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以下是DSPE-PEG2000-CY3標記脂質體制備的標準化流程，整合了薄膜水化法和化學偶聯技術的實踐：

一、材料準備

脂質成分?

主膜材：DSPC/DSPG/HSPC等磷脂（占總脂質的60-70 mol%）

膽固醇（調控膜流動性，占20-30 mol%）

DSPE-PEG2000-CY3（熒光標記成分，建議添加量0.5-5 mol%）

溶劑體系?

氯仿/甲醇混合液（體積比2:1）用于溶解脂質

PBS緩沖液（pH 7.4）或去離子水用于水化

設備?

旋轉蒸發儀、超聲破碎儀、聚碳酸酯膜擠出裝置（100-200 nm孔徑）

二、制備流程

步驟1：脂質混合溶液配制

按設計的摩爾比例稱取各組分（例：DSPC:膽固醇=65:30:5 mol%）

用氯仿/甲醇混合液溶解，超聲處理10分鐘至澄清（有機相體積建議為總水化體積的1/10）

步驟2：脂質膜形成

將混合液轉移至圓底燒瓶，40-50℃旋轉蒸發至形成均勻薄膜

真空干燥2小時徹底去除溶劑殘留

步驟3：水化與均質化

加入預熱至50℃的PBS緩沖液（推薦水化體積5-10 mL/g脂質）

渦旋震蕩30分鐘形成多層脂質體（MLVs）

依次通過400 nm、200 nm、100 nm聚碳酸酯膜擠出10次，獲得粒徑100-150 nm的單層脂質體

步驟4：純化與表征

采用超濾離心（MWCO 100 kDa）或透析法去除未包封物質

動態光散射（DLS）檢測粒徑分布（PDI<0.2為合格）

熒光分光光度計驗證CY3標記效率（激發550 nm/發射570 nm）

三、關鍵控制點

參數技術要求依據來源

PEG化比例≤5 mol%以避免空間位阻效應

擠出溫度高于磷脂相變溫度（DSPC需≥55℃）

避光操作全程棕色玻璃器皿/遮光環境

CY3穩定性終產物4℃避光保存≤7天

四、替代方案（后修飾法）

若需提高標記效率可采用分步修飾：

先制備含DSPE-PEG2000-NH?的脂質體

通過NHS酯反應將CY3偶聯至表面氨基（pH 8.5緩沖液，4℃孵育12小時）

超濾去除游離染料（需驗證偶聯效率≥80%）

注：推薦優先采用共混法制備，因其操作簡便且對CY3熒光團損傷較小。實驗設計需根據具體應用場景調整PEG密度與CY3濃度。